用于基因治療的臨床級(jí)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)已經(jīng)應(yīng)用于一些病癥，這種病毒載體修飾體細(xì)胞需要具有基因穩(wěn)定性。γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是首次應(yīng)用于治療嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷患者。
如今，基于更加復(fù)雜的慢病毒設(shè)計(jì)的其他逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，如人免疫缺陷病毒（HIV）-1，已經(jīng)在臨床上用于治療遺傳性疾病或HIV感染。
慢病毒載體（LV）提供了許多有價(jià)值的特性，包括穩(wěn)定的將基因整合到宿主基因組中，通過(guò)VSV-G假型分型將遺傳信息轉(zhuǎn)移到分裂和非分裂細(xì)胞以及廣泛的組織趨向性能力。
目前正在臨床試驗(yàn)中用于治療罕見(jiàn)和更頻密的遺傳和后天疾病，以及CAR-T細(xì)胞癌癥治療。慢病毒載體（LV）是基因和細(xì)胞治療應(yīng)用的關(guān)鍵工具。目前如何為臨床應(yīng)用提供足夠數(shù)量的載體仍是一個(gè)難題。
采用貼壁細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒
大多數(shù)大規(guī)模生產(chǎn)都是小規(guī)模生產(chǎn)的直接放大，即通過(guò)增加培養(yǎng)/生產(chǎn)單元來(lái)實(shí)現(xiàn)。生產(chǎn)基本上采用大量的多層培養(yǎng)系統(tǒng)（Cell Factories（CF）（CF-10））或者Cell Stacks（CS）（如圖）。
耐思10層細(xì)胞工廠（BioFactory?）
分不同蓋型
因?yàn)橐子诓僮鳎?0疊層裝置（CS-10）是首選，雖然原則上40疊層裝置同樣也可以用，但是因?yàn)樗亓吭黾拥脑蛩孕枰厥獾奶幚硐到y(tǒng)。此外，每層平板的氣體交換及培養(yǎng)基層不可能一致，因此用顯微鏡控制40疊層裝置細(xì)胞的生長(zhǎng)很困難。生產(chǎn)要么采用放在層流工作臺(tái)的開(kāi)放模式，要么采用半封閉模式，后者對(duì)操作人員、環(huán)境及終產(chǎn)品的安全性更高。
收獲是通過(guò)簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基置換完成的，在某些情況下，通過(guò)增加收獲次數(shù)來(lái)提高最終慢病毒的質(zhì)量。然而，在臨床前及臨床級(jí)大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，頻繁收獲是不現(xiàn)實(shí)的，因此在大多數(shù)時(shí)候只是收獲1-3次。
根據(jù)10疊層培養(yǎng)設(shè)備的數(shù)量及收獲次數(shù)的多少，可采用10-24個(gè)CF-10設(shè)備一次生產(chǎn)周期可以收獲的體積介于20-52升之間。
在貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)中，培養(yǎng)上清可以間隔一天收獲兩次，這是一個(gè)提高成本效益的好方法。在懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，這種方法很難實(shí)現(xiàn)。
采用懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)慢病毒
雖然轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞是生產(chǎn)慢病毒的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但是這個(gè)方法在擴(kuò)大規(guī)模上受限。對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，在大的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞通常是最便捷的方式。
在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)需要對(duì)懸浮的生產(chǎn)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。多個(gè)用于生產(chǎn)慢病毒的細(xì)胞系(293T、293FT、293SF-3F6)被報(bào)道易于在化學(xué)成分限定的培養(yǎng)基(Freestyle 293 and F17, Invitrogen, Carlsbad, CA; HyQSFM4TransFx293, Hyclone, Logan, UT)中適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。這些細(xì)胞可以在沒(méi)有為載體的情況下迅速懸浮生長(zhǎng)，這使得它們的培養(yǎng)和擴(kuò)大比貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞容易很多。此外，培養(yǎng)基中沒(méi)有牛血清及其他動(dòng)物來(lái)源的組分是臨床生產(chǎn)最合適的情況，它可以降低被外源物質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)。
在懸浮培養(yǎng)模式下，細(xì)胞可以通過(guò)不同的容器進(jìn)行擴(kuò)大：搖瓶、玻璃生物反應(yīng)器、不銹鋼生物反應(yīng)器、培養(yǎng)袋及一次性攪拌容器。有報(bào)道采用HEK293T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染、慢病毒生產(chǎn)可以用一次性的生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)50L的規(guī)模。
耐思搖瓶系列（容量：125mL、250mL、500mL、1000mL）
適用于培養(yǎng)懸浮細(xì)胞
利用懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒是可行的，并且顯示出良好的產(chǎn)量。但是，在轉(zhuǎn)移到工業(yè)生產(chǎn)之前，該技術(shù)還需要進(jìn)一步完善。優(yōu)化的主要瓶頸是轉(zhuǎn)染過(guò)程本身，它需要大量質(zhì)粒DNA，從而使生產(chǎn)過(guò)程極其昂貴。一種工業(yè)友好、減少DNA的消耗、提高生產(chǎn)細(xì)胞的百分比的轉(zhuǎn)染技術(shù)是使這一過(guò)程在未來(lái)工業(yè)中有利可圖的關(guān)鍵因素。
