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實(shí)驗(yàn) | 細(xì)胞增殖檢測(cè)-軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)

NEST

實(shí)驗(yàn)時(shí)刻

軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)

軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)(Anehorage-independentassay),利用軟瓊脂為培養(yǎng)介質(zhì),使細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)。

軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單,適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。

細(xì)胞克隆形成率表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量,主要反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。

Part 01.

實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、瓊脂糖、結(jié)晶紫
細(xì)胞培養(yǎng)板、微量離心管(EP管)、移液吸頭、移液槍



Part 02.

實(shí)驗(yàn)操作流程

1.提前配置1.2%和0.7%瓊脂(Agarose 加蒸餾水配置),高壓滅菌后4攝氏度冰箱保存。鋪板當(dāng)天微波爐或烘箱加熱融化,置于37攝氏度培養(yǎng)箱中。
2.鋪下層膠:按1:1比例混勻1.2%Agarose和20%1640,6孔板每孔取2毫升混合液,在室溫條件下等待冷卻凝固。
3.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,消化配置成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為5*10^4/毫升。
4.鋪上層膠:按1:1比例使0.7%Agarose和20%1640培養(yǎng)基混勻,取2毫升混合液于EP管中,向管中加入10-20微升細(xì)胞懸液,充分混勻后加入已鋪下層膠的6孔板中,待上層瓊脂凝固后,放在37攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周,每三天向孔板中加入200微升培養(yǎng)基。
5.顯微鏡下拍照,統(tǒng)計(jì)克隆直徑并作圖。



常見(jiàn)問(wèn)題與解答

Q:細(xì)胞密度為多少合適?

A:細(xì)胞接種密度與最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果密切相關(guān),若細(xì)胞太多,形成克隆數(shù)目太多,處理結(jié)果時(shí)數(shù)克隆不僅容易出錯(cuò),而且圖片很難看(下圖左)。細(xì)胞太少,不能形成克隆。如下圖所示:

上圖我們看到3株癌細(xì)胞在6孔板克隆形成圖片,第一個(gè)明顯鋪板細(xì)胞太密集,導(dǎo)致難以統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù);中間那個(gè)正好,最后面那個(gè)細(xì)胞數(shù)量偏少,且細(xì)胞鋪板不均勻。因此,為了獲得美觀的圖片和準(zhǔn)確的數(shù)據(jù),第一次實(shí)驗(yàn)最好設(shè)置細(xì)胞接種梯度,如500-1000-2000-5000個(gè)/孔挑選出最合適的接種密度。細(xì)胞在進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)時(shí)要求有95%以上的分散度,否則結(jié)果的準(zhǔn)確度會(huì)受到很大影響;另外注意細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)建議多計(jì)數(shù)幾次。

Q:細(xì)胞接種后培養(yǎng)的時(shí)間,如何確定?
A:通常情況下,單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上所組成的細(xì)胞群稱為一個(gè)陽(yáng)性克隆,時(shí)間約為一周;但具體時(shí)間因細(xì)胞增殖能力而已異,因此應(yīng)密切關(guān)注細(xì)胞生長(zhǎng)情況,隔天在顯微鏡下觀察克隆情況,若單個(gè)克隆細(xì)胞數(shù)到達(dá)50個(gè)左右即可固定細(xì)胞。
Q:細(xì)胞鋪板均勻的重要性
A:若鋪板不均勻,細(xì)胞稀的地方形成的克隆少,而密的地方克隆多,一方面影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果,并且拍出的圖片不美觀。
Q:細(xì)胞未形成克隆的原因?

A:并非每種細(xì)胞都可以形成克隆,克隆形成率與細(xì)胞本身增殖能力有關(guān)。還與接種細(xì)胞密度,加入培養(yǎng)液的體積、血清濃度有關(guān)。因該實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間較長(zhǎng),應(yīng)給細(xì)胞多加培養(yǎng)基,如每孔4ml,或者3天更換一次培養(yǎng)基,以供給細(xì)胞充足的營(yíng)養(yǎng)。


Q:計(jì)數(shù)時(shí)克隆數(shù)目較多,有什么快捷辦法?
A:只要細(xì)胞鋪板均勻,我們可以選擇分區(qū)計(jì)數(shù),取平均數(shù)。
注意事項(xiàng)
1.細(xì)胞一定要吹打分散成單細(xì)胞懸液
2.接種時(shí)細(xì)胞密度不可過(guò)高
3.軟瓊脂與細(xì)胞混合時(shí)溫度不可過(guò)高,容易燙傷甚至燙死細(xì)胞。
4.軟瓊脂對(duì)熱和酸不穩(wěn)定,反復(fù)加熱容易降解并產(chǎn)生毒性,且容易造成硬度下降,因此需要高壓滅菌后進(jìn)行分裝。
5.鋪板操作時(shí)速度要快,以免造成局部凝固。


END

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